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乳酸链球菌素生产技术工艺

    乳酸链球菌素是由乳酸链球菌发酵培养精制而制成,主要包括三个关键步骤:
    ①菌种筛选。
    取样:乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶、乳酪和酸奶中。这种菌是乳制品中的主要污染菌,在健康奶牛乳房中不存在,但在生牛乳中能分离出来,可能来自毛、粪以及挤奶桶等,因此,取样时的样品主要取自子鲜奶;
    增殖培养:用吸管从样品中吸取少量奶液,接于灭过菌的脱脂奶管中,在恒温箱中于30℃下培养,直到脱脂奶凝固。
    活化:将增殖培养的脱脂奶管中的凝乳,再次转接于无菌脱脂奶管中,30℃的恒温箱中培养,至脱脂奶凝固,反复转接活化,直至凝乳时间为3~3.5h为宜。
    分离纯化:将活化好的样品逐级稀释至 10-7,用无菌吸管吸取稀释液1ml,放于无菌平皿中,30℃恒温培养2-3天,然后从平皿中挑取单部曲落,转接于斜面培养基上,30℃恒温培养2-3天,最后进行鉴定。
    鉴定:镜检,杆菌者弃去,球菌进行革兰氏染色,呈阴性者弃去,阳性者迸行葡萄糖发酵试验,须产生乳酸,且VP试验呈阴性,呈阳性弃去。所需菌种在10℃、40℃下生长,45℃下不生长;在含4%NaCI的培养基中能生长,在含6.5%NaCl的培养基中不生长;在PH值9.2条件下能生长,在PH值9.6的条件下不生长;在含0.1%美兰的脱脂奶管中能生长,能由精氨酸产氨。符合上述条件者即为所耍筛选的菌株。若想获取更高产菌株,可对原始菌株再进行诱变处理。
   
    ②发酵。不同的乳酸链球菌株,其产NiSin的效价也有显著的变化,所适应的发酵条件也各有所不同。综合来看,在碳源上,最适合的主要为蔗槽和可溶性淀粉。最适氮源,主耍为酵母膏,添加量 1%左右。磷源一般认为KH2PO4最合适,添加量<=5%。NiSin的高效价在很大程度上也依赖于硫源的存在.添加无机盐类如硫酸镁、硫代硫酸盐或含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸等,均有较好效果。另外,吐温-80对细胞的生长及NISin的产生均有利。最适发酵温度为30℃左右,最适PH值为5.0-5.5或6.5左右。

    ③精制。目前,采用的方法一般为将NaCI饱和的乳酸链球菌发酵液经正丙醇提取2次,再用丙酮沉淀可得到乳酸链球菌素粗制品。将粗制品溶于0.05mol/L HAc-NaAc(PH值为3.6)缓冲液中,并用缓冲液透析24h,离心后经柱层析,可使NiSin的效价及纯度大大捉高,再经喷雾干噪、研细及用 NaCl调整,即可制成NiSin成品。以英国阿普林与巴雷特公司的产品 Nisaplin为例,其组成为: NiSinl*106IU/g,氯化钠74.5%,变性乳固体23.8%,水分1.7%。
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